纳米照明首次实现片上大视场无标记远场纳米显微成像

近期，浙江大学刘旭、杨青课题组在超分辨显微成像领域取得了重要研究进展。他们利用移频成像原理，开创性地将发光纳米线环作为局域光源与二维薄膜波导相耦合，巧妙地利用了纳米光源小尺寸、大表体比、强光局域能力和强倏逝场等特点，首次实现了片上的大视场、远场、无标记的超分辨显微成像，分辨率较传统显微方法提升了5倍，且其视场比以往报道的无标记型远场超分辨显微方法扩展了2个数量级。

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光学显微镜自16世纪发明以来，成为了人们探索微观世界的重要工具。从列文虎克用自制的显微镜首次揭示微生物的存在到集成芯片微小缺陷的检测，显微技术的发展在近一个世纪的时间里突飞猛进，在1953年、1986年和2014年三次获得了诺贝尔奖，极大地促进了生物医学、物理和化学等领域的发展。

图1 光学显微成像的重要发展历程

最初，人们认为，只要显微镜片的制作足够精细，理论上可以观察到任何微小的尺寸。然而，19世纪末，德国物理学家恩斯特·阿贝发现了“衍射极限”的存在，即光作为一种波，它的聚焦能力会受光学系统的孔径（Numerical aperture，NA）和光波长的限制，聚焦光斑的尺寸不可能小于（0.61×λ）/ NA。这一特性限制了在可见光波段显微成像的分辨能力，使200 nm以下的微小结构无法被传统的显微方法观察。而打破衍射极限，实现“超分辨成像”，对人类科学取得突破性发展至关重要，因而成为了国内外研究者孜孜以求的目标。

2014年诺贝尔化学奖颁给了Stefan W. Hell，Eric Betzig 和 William E. Moerner，以表彰他们发明的受激发射损耗显微成像（Stimulated Emission Depletion（STED）microscopy）和单分子显微成像（Single-molecule Microscopy）将荧光显微镜的分辨率提高到了纳米量级，为生物和医学的发展提供了有力的研究手段。这些技术首先利用特殊的荧光颗粒对生物组织进行染色标记，然后通过使用荧光颗粒的非线性效应而将距离很近的结构分辨开来。但同时，基于荧光标记样品的成像方法对荧光颗粒和成像样品都有着较为严格的要求，普适性不强，且遇到了成像速度慢、易引起生物体排异反应等瓶颈。所需要的显微系统昂贵而复杂。

相比起来，非荧光标记的超分辨显微方法在活体成像、多类样品成像和快速成像等方面具有天然的优势。然而其发展却非常缓慢，难以满足材料、信息、医学和生物科学等领域在无标记样品检测方面的迫切需求。国际上多个知名课题组对其展开研究，微球接触、极透镜等技术相继被发明，但仍面临着光谱范围单一、视场狭窄等限制。探索并发展宽视场、远场且结构与相位均能快速成像的新型非荧光标记超分辨显微方法成为人们关注的难点与热点。

最近，该课题组利用移频成像原理（如下视频中所示），开创性地将发光纳米线环作为局域光源，巧妙地利用其小尺寸、大表面积体积比、强光局域能力和强倏逝场等特点，并与低传播损耗、高折射率的薄膜波导相耦合，首次实现了片上的大视场、远场、无标记的超分辨显微成像，分辨率较传统显微方法提升了5倍，且其视场比以往报道的无标记型远场超分辨显微方法扩展了2个数量级。

该方法是一种片上移频显微术，整个结构集成在一片毫米量级厚，厘米量级宽的硅片上，将之放入普通显微系统代替传统的载玻片，只需要激发片上的纳米线光源发出荧光，即可使普通显微镜具备超分辨能力，实现从传统显微镜到超分辨显微镜的飞跃提升。结构如图2 (a)所示。图2（b）为利用该方法观察特征尺寸在几十纳米量级的“ZJU”图案效果。

图2 纳米线环形照明显微术机理示意图(a)及“ZJU”结构观察效果图(b)

目前，该技术在集成芯片、蓝光DVD、3T3-l1癌细胞等多类亚波长样品上均得到验证，显示了其普适性强，使用方便的优点。图3所示为使用该方法观察蓝光光碟和集成电路的效果图。纳米照明移频显微芯片的小尺寸、低功耗和高度兼容性使其在生物医学、集成芯片和材料学等重要领域具有广阔的应用前景，同时芯片化的设计可演化成主板型光学显微镜，为下一代光学显微镜提供颠覆性的设计理念。

图3 NWRIM在蓝光光碟和集成电路上的应用效果图。(a) 蓝光光碟的普通显微成像；(b) 蓝光光碟在纳米线环照明下的成像；(c) 集成电路的普通显微成像；(d) 集成电路在纳米线环照明下的成像；(e) 子图(c)与(d)中白色方框标示区域的电子显微镜照片；(f)子图(c)与(d)中沿蓝色虚线所描绘的成像强度分布。

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