基于其高灵敏度和便携性，细胞传感器已成为传统毒物毒性评价的一种具有吸引力的评估手段。近年来，许多研究表明三维的细胞培养环境可以更好地模拟体内微环境，从而更准确地监测细胞对外源性危害的反应。在三维细胞传感器的设计上，海藻酸钠、鼠尾胶原和琼脂糖等天然水凝胶常常被用以细胞在电极上的固定化。然而，这些水凝胶通常导电性和可塑性较差，且极易从电极表面脱落分离。此外，通过人工来修饰电极也会给测试结果带来很大的个体误差。因此，如何提高有效性、稳定性及实现可批量性生产仍是生物传感器研发的一项挑战。

来自江南大学的孙秀兰教授团队在“Bioelectrochemistry”上发表的“3D ‘honeycomb’ cell/carbon nanofiber/gelatin methacryloyl (GelMA) modified screen-printed electrode for electrochemical assessment of the combined toxicity of deoxynivalenol family mycotoxins”一文中，研究人员将3D打印技术引入生物传感器的构建过程，实现了精确、快速、可批量化地生产真菌毒素的毒性分析工具的目的。该方法是利用碳纳米纤维/明胶甲基丙烯酰基（GelMA）复合导电水凝胶构建了三维细胞培养体系，通过电化学交流阻抗法测定其阻抗值判断细胞受毒素刺激后的受损情况，从而真实、有效地评价真菌毒素细胞毒性。结合联合指数法（CI）对DON、3-ADON及15-ADON的联合毒性分析，并判定联合作用类型。结果表明，该方法操作简便、可重复性强，显示了高通量在线检测分析的潜力，为真菌毒素的细胞毒性评估提供了一种新思路。

图1 细胞电化学传感器的构建过程及其表征

首先，研究人员利用EFL团队提供的挤出式生物3D打印机（EFL-BP-6601）和GelMA生物墨水（EFL-GM-60）制备了一种电化学传感器，并对其实验条件进行了相关的优化。为提高丝网印刷电极（SPCE）的电化学灵敏度，金纳米粒子（AuNP）被电镀在SPCE的工作电极上，并通过掺入碳纳米纤维进一步提高GelMA水凝胶的导电性。打印填充方式的优化中，“蜂巢”型的打印填充方式显示出了优于其他填充方式的导电性能。A549细胞/碳纳米纤维/GelMA复合水凝胶通过3D打印程序被精确沉积于8通道丝网印刷电极的工作电极上，从而得到细胞电化学传感器。水凝胶为细胞提供了类体内的生长环境并能促进细胞间相互作用。完整细胞膜的存在防止了氧化还原探针进入电极表面，从而增加了电子传递阻力。当霉菌毒素刺激细胞时，发生细胞凋亡和死亡。因此，电子转移加快了工作电极的导电率，根据细胞传感器的阻抗值便可测得真菌毒素的细胞毒性。

其次，由于不同浓度的GelMA水凝胶会表现出不同的加工性能和生物相容性特征，研究人员评估了不同浓度的GelMA水凝胶的电导率及其对细胞活力的影响。结果表明，随着GelMA浓度的增加，丝网印刷电极的电流值降低（图2A），可见高浓度的GelMA不利于电子传输。活/死细胞染色分析（图2C）可发现，细胞在低浓度（5％-7.5％）的GelMA水凝胶中生长良好，并能观察到细胞分化过程中的形态变化，细胞聚集成簇（如红色框所示）。经统计分析（图2B），A549细胞在5％-7.5％浓度的GelMA水凝胶中的存活率更高，超过93％。

图2 不同GelMA浓度的电导率和生物相容性的比较

最后，将构建的细胞传感器暴露于不同浓度的DON、3-ADON和15-ADON中，以分析每种霉菌毒素的毒性。构建的电化学毒性评价方法表明，真菌毒素降低了A549细胞的活性（图3）。在三种霉菌毒素中，DON最有效地降低细胞活力，而3-ADON表现出最弱的细胞毒性。三种真菌毒素的半数致死率（IC50）如下：DON 0.9353 μg/ mL、3-ADON12.3194 μg/ mL和15-ADON1.3360 μg/ mL。为评估构造的细胞电化学传感器的准确性，将本方法获得的结果与传统毒性评价方法CCK-8获得的结果进行了比较，可见两种方法的结果具有良好的一致性。

使用所构建的电化学方法进一步对DON、3-ADON和15-ADON的联合毒性进行研究。图4显示了两种或三种不同浓度比例的DON及其衍生物组合的联合细胞毒性作用。采用CI联合指数模型分析了各毒素组合的联合毒性效应。结果表明，DON +3-ADON、DON +15-ADON和DON +3-ADON + 15-DON的混合物对A549细胞产生几乎完全拮抗的细胞毒性，而3-ADON和15-ADON的组合在低细胞抑制水平上发挥协同作用，而在中高细胞抑制水平则产生拮抗作用。

图3 A549细胞暴露于DON、3-ADON和15-ADON后的细胞抑制率曲线（以CCK-8法和构建的电化学方法作为比较）

图4 DON、3-ADON和15-ADON联合作用于A549细胞后的细胞抑制率曲线（以CCK-8法和构建的电化学方法作为比较）

用于评估细胞毒性的传感器适用于各种传感应用，包括毒素检测和药物评价。利用细胞作为生物传感器元件可以在一定程度上模拟人体的生理反应，目前也已经提出了许多用于毒性评价的生物传感器的研究。然而大多数细胞传感器的构建都是基于人工操作，不可避免地会引入人为误差。本研究开发了一种基于生物打印的可用于多样品检测的电化学传感器，用于评价DON及其乙酰化衍生物的单一和联合毒性。本研究表明，DON、3-ADON和15-ADON以剂量依赖性的方式引起细胞活力的显著降低，本文中的常规毒理指标的检测结果还发现细胞内环境信息系统与ROS水平、细胞内Ca2+浓度、凋亡率和坏死率均有关系。该方法简单、有效，为可批量化地生产毒物的细胞毒性评价工具提供新的方向。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107743